T7 耐热RNA聚合酶2.0  JNC9A3603

T7 耐热RNA聚合酶2.0

描述：

T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 是一种经基因工程改造的 DNA 依赖性 RNA 聚合酶，对 T7 噬菌体启动子（TAATACGACT CACTATAG）具有高度特异性，跟野生型噬菌体 T7 RNA 聚合酶相比，它可在更高的温度下进行体外转录。T7 耐热 RNA 聚合酶 2.0 可在 37-52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为 37℃，50℃反应条件下，仍然保留 50%以上的活性（野生型在此温度下无活性）。这种高温的反应特性有益于以下几个方面的实验：（1）提升了 GC 含量较高 RNA 的转录效率；（2）提升了长片段 RNA 的合成能力；（3）在使用帽类似物时，提高了共转录的加帽效率；（4）减少了 dsRNA 副产物的形成，降低了合成 RNA 的免疫原性。

活性定义：在标准反应体系下，50℃ 1 小时内将 1 nmol的 ATP 掺入酸不溶物所需要的酶量定义为一个活性单位。 

1X T7 Transcription Buffer：40 mM Tris (pH 7.8), 20 mMNaCl, 18mM MgCl₂,2 mM Spermidine HCl, 10 mM DTT酶储存液：10 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, 0.01% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 

储存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反复冻融。 

热失活：75°C，10min。

操作方法 

1.配制反应体系

2. 50℃孵育 1-3h。 

3. 使用 RNaseFree DnaseI 去除 DNA 模板（可选）在体外转录反应结束后，向上述 20μl 反应液中加入5μl 的 10×RD Buffer 和 2μl RNaseFree DnaseI(10U/μl)，并加入 23μl 的 Rnase Free H2O 至 50μl，37℃孵育15min。 

4. 转录产物的纯化体外转录产物可选用 5minRNA 纯化试剂盒进行柱式纯化，以去除多余的盐、蛋白等杂质。也可以采用经典的LiCl 沉淀法。 

注意事项 

1. 转录DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。 

2. 转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RnaseA会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板。 

3. 该酶对高浓度 NaCl 或 KCl 不耐受，当其浓度高于150mM 时，其活性受到显著抑制（~50%）。 

4. 在 20μl 反应体系中加入 0.02U 热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量（提高 25~50%）。

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