碱性磷酸酶
中文名:碱性磷酸酶
英文名:Phophatase Alkaline,Calf Intestine(CIPA)
CAS:9001-78-9级别:Reagent Grada
分子量:N/A分子式:N/A
纯度:≥1500 units/mg储存条件:-20℃
产品简介
碱性磷酸酶来源于牛肠粘膜。
牛肠碱性磷酸酶为二聚膜衍生糖蛋白。至少存在三种同工酶，每个单体通常拥有两个 N-连接多糖和一个或多个 O-连接多糖。该酶需要锌以及镁或钙二价离子才能显示活性。
单位定义：在pH 9.8,37℃条件下，一个DEA单位可每分钟水解1 μmole的4-硝基苯基磷酸酯。（一个甘氨酸单位相当于~3个DEA单位）。
应用：碱性磷酸酶可用于酪蛋白和其他蛋白质的去磷酸化。碱性磷酸酶还可用于 DNA 或 RNA 的 5′-末端的去磷酸化，以防止自我连接。经碱性磷酸酶的去磷酸化作用后，DNA 或 RNA 还可被放射性标记磷酸盐标记（通过 T4 多核苷酸激酶）。
高浓度的酶稳定性更高。碱性磷酸酶以高浓度母液形式提供，并附赠稀释液（含Mg2+，Zn2+，甘油等）和10×反应缓冲液。
产品组成：
使用方法（以之为例）：
1. 在微量离心管中配制 50 μL 反应体系：
（DNA Fragment 1~20 pmol；10×反应液 5μL ；碱性磷酸酶 30U ；补水到50μL）
2. 37℃或 50℃反应 30 分钟。或者先 37℃反应 15 分钟，再 50℃反应 15 分钟。注 意：单链 DNA 和具有 5’突出末端 的 DNA 在较低温度下（如 37℃）即可去磷 酸化，而具有 3’突出末端的 DNA 或平末端 DNA 需要较高温度（如 50℃）才能 去磷酸化。
3. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提 2 次。注意：如果早在苯酚抽提之前，用 自备的蛋白酶 K 降解 CIAP 酶，则效果更好。具体做法是：加入 EDTA 和 SDS 使其终浓度为 5 mM EDTA 和 0.5% SDS，最后加入蛋白酶 K 溶液，使其终浓度 为 50 μg/mL，然后 56℃处理 30 分钟，再 75℃孵育 10 分钟。然后用于苯酚/ 氯仿/异戊醇抽提。
4. 氯仿/异戊醇（24：1）抽提 1 次。
5. 添加 2.5 μl 的 3 M NaCl（终浓度 150 mM）。
6. 添加 125 μl 的（2.5 倍量）冷乙醇，在-20℃下放置 30～60 分钟。
7. 13000g 离心 20 分钟后，小心去上清。
8. 用 1mL 75%乙醇洗涤一次。
9. 干甩数秒，小心吸弃上清。
10. 用 20 μl 以下的 TE Buffer 溶解 DNA 沉淀待用或放-20℃长期放置。
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