一站式平末端克隆试剂盒
产品及特点
本产品是一种能使 DNA 片段的末端平滑化、5’端的磷酸化、DNA 片段 和载体的连接等诸反应高效快速完成的试剂盒。它具有下列特点：
1. 适用范围包括：由高保真 DNA 聚合酶如 Pfu、Pwo、DeepVent 等扩增 而来的 PCR 产物；一些限制性内切酶如 EcoRV、SmaI 等酶切产生的 DNA 片段；粘端 DNA 用 DNA 聚合酶补平后的片段。
2. DNA 片段的末端平滑化反应和 5’端的磷酸化反应可在一个反应体系中同 时进行，反应时间只需 10 min。
3. 本试剂盒中还含有高效的 DNA 连接液，可在短时间内完成连接反应。
规格及成分
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。
自备试剂 DNA 片段等。
使用方法 一、用 PCR 反应液直接进行克隆时 : Blunting Kination 反应
1. 在微量离心管中配制下列反应液。
2. 37℃反应 10 min。
3. 70℃热处理 5 min。
Ligation 反应
4. 取 3. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。
5. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL），混合均匀。
6. 加入 6 μL 的连接反应溶液（连接反应溶液请于冰中融解，使用前混匀。应避免多次反复冻融。），混合。
7. 16℃反应 1 h。
8. 全量转化 100 μL 的感受态细胞。
注意：用电刺激法做细菌转化时，先用乙醇沉淀或苯酚抽提等方法置换DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；PCR 产物中混有非特异性 DNA 时，可以通过琼脂糖凝胶电泳回收目的 DNA 片段；PCR 反应液最适用量 2 μL，用量过多会降低反应效率。如需提高 DNA 用量请用乙醇沉淀法精制 DNA片段后再进行反应。
二、用精制后的 DNA 片段进行克隆时 ：
Blunting Kination 反应
9. 在微量离心管中配制以下反应液。
10. 37℃反应 10 min。
11. 70℃热处理 5 min。
Ligation 反应
12. 取 11. 的溶液 5 μL 到另一个新的微量离心管中。
13. 加入 1 μL 经过去磷酸化处理的平滑末端载体 DNA（50-100 ng/μL）混合均匀。
14. 加入 6 μL 的连接反应溶液，混合。
15. 16℃反应 1 h。
16. 全量反应液用于转化 100 μL 的感受态细胞。
注意：用电刺激法做细菌转化时，先用苯酚抽提和乙醇沉淀等方法置换DNA 溶解缓冲液后再进行电转化；插入 DNA 与载体 DNA 的摩尔数比应为 2﹕1-10﹕1。
仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。
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