15%尿素-PAGE制胶液（DNA，microRNA）
中文名:15%尿素-PAGE制胶液（DNA，microRNA）
英文名:15% Urea-PAGE Gel solution
CAS:N/A级别:N/A
分子量:N/A分子式:N/A
纯度:N/A储存条件:RT
产品简介
储存条件：4℃保存，有效期1年。
产品组成：
注意：过硫酸铵（APS）为固体粉末，使用前配制成10% APS溶液（0.1 g APS加1mL双蒸水）。APS溶液最好现配现用，通常4℃可保存一周，-20℃能保存半年。
准备工作：
估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块 13 cm×15 cm× 0.8 mm 的胶需要 15 mL 凝胶溶液，配制一块 36 cm×45 cm×0.8 mm 的胶需要 120 mL 凝胶溶液。
操作步骤：
1. 取适量的制胶液于三角瓶中，边摇晃溶液边加入TEMED 和10%过硫酸铵。（建议每100mL的加入量：10% APS 500uL，50-100uL的TEMED）
2. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟等待胶凝固。
3. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×TBE电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
4. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
5. 在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可 以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。
6. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNA上样液混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。
7. 关电泳仪后开始上样。
8. 重开电泳仪，对 13 cm×15 cm 的胶，以 20-30mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对 36 cm×45 cm 的胶，则以 50-60mA 的 电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
9. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每 100 mL 1×TBE 中加 20 uL 10mg/mL 的 EB 溶液）。UV 下观察并拍照。
10. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后进行胶回收处理。
11. Northern 杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。
12. 放射自显影：如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的 玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保 鲜膜，真空抽干，然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。
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