毕赤酵母感受态制备与转化试剂盒
中文名:毕赤酵母感受态制备与转化试剂盒
英文名:Pichia pastoris positive clone assay kit
CAS:N/A级别:N/A
分子量:N/A分子式:N/A
纯度:N/A储存条件:-20℃
产品简介
储存条件： -20 ℃保存，未开封有效期24个月。
产品内容：
一、毕赤酵母感受态细胞的制备
1.活化菌种。-80 ℃保存的菌种在固体YPD培养基平板上划线，30 ℃培养2-4天。
2.选取酵母菌落接种到10 mL液体YPD培养基中，30 ℃摇床过夜培养后将培养物按1%的接种量接种到100 mL液体YPD培养基中三角瓶中培养至OD值为0.6-1.0。
注：每10 mL菌液可用于一次转化。以下操作步骤适用于10 mL菌液。
3.3,000 rpm离心3 min收集菌体沉淀。
4.加入5 mL B1溶液重悬菌体，3,000 rpm离心3 min收集菌体沉淀。
5.再加入200 μL B1溶液重悬菌体，转移到无菌1.5 mL离心管，即为制备好的感受态细胞，可直接用于转化或冻存备用。
6. 制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后，再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒，或用多层纸包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱过夜后，再取出感受态置于-80 ℃冰箱，可保存半年。使用前冰上解冻或直接用于转化。
注：缓慢冷冻会保证良好的转化效率。扩大酵母菌培养体积，相应增加冻存液的使用量，可以一次性制备多只毕赤酵母感受态细胞。
二、毕赤酵母转化
1.取0.1-5 μg质粒DNA（线性化质粒加入量5-50 μg）和10 μL预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上，置于30 ℃水浴，每隔15 s颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化。（融化后及时取出）
2.加入1.4 mL B2溶液颠倒混匀。30 ℃水浴60 min。
3.3,000 rpm离心3 min弃上清留菌体沉淀，加入1 mL B3溶液重悬菌体。
4.3,000 rpm 离心3 min 弃上清留菌体沉淀，加入100 μL B3溶液重悬菌体。
5.将100 μL菌液全部涂布到相应的平板培养基，30 ℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。
注意事项：初次使用Carrier DNA，请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5 min，然后立即放在冰上，用后放在-20 ℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3-5次后需重新变性Carrier DNA。
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